Gli argomenti del corso affronteranno vari aspetti della biologia molecolare che includono le tecniche di espressione eterologa di proteine: dal DNA genomico all'isolamento della proteina. Estrazione di geni e procedure di clonaggio classiche e moderne ad alta efficienza. Le tecniche di over-espressione proteica in organismi batterici e in sistemi cell-free. Procedure di purificazione di proteine. Modificazioni post traslazionali di proteine. Procedure in vivo e in vitro per la ricostituzione dei siti metallici in metallo proteine. Conseguimento di marcatura isotopica uniforme e selettiva in proteine over-espresse.
T.A. Brown Gene Cloning: an Introduction Ed. Chapman & Hall; Keith Wilson and John Walker Metodologia biochimica, Raffaello Cortina Editore; Ivano Bertini, Harry B. Gray, Edward I. Stiefel, Joan Selverstone Valentine, Biological Inorganic Chemistry Ed. University Science Book
Obiettivi Formativi
Acquisire le conoscenze e le metodologie richieste nell’espressione eterologa di metalloproteine in organismi batterici, eucariotici e sistemi in vitro. Sviluppare le abilità di base nelle operazioni fondamentali di un laboratorio di espressione eterologa di metalloproteine attraverso esercitazioni a gruppi. L’obiettivo finale dell'insegnamento e’ quello di rendere lo studente capace di esprimere e purificare una metalloproteina allo scopo di essere studiata mediante analisi spettroscopiche.
Prerequisiti
Insegnamenti contenenti i prerequisiti (vincolanti e/o consigliati)
Corsi vincolanti: nessuno
Corsi raccomandati: nessuno
Metodi Didattici
Numero di ore relative alle attività in aula: 25
Numero di ore relative ad attività di esercitazioni (in laboratorio e in campo): 35
Modalità di verifica apprendimento
Esame integrato con Struttura e reattività di metallo proteine (minimo otto appelli annuali).
Programma del corso
Il programma del corso affronterà le tecniche di espressione eterologa di proteine: dal DNA genomico all'isolamento della proteina. Saranno spiegate le basilari procedure di estrazione di geni e di clonaggio. In particolare saranno descritti, i due principali approcci del clonaggio di geni basati il primo sugli enzimi di restrizione e il secondo sul sistema Gateway. L'espressione e la overespressione proteica in organismi batterici e in sistemi cell-free e le procedure di purificazione delle proteine così ottenute saranno poi affrontate sia da un punto di vista teorico che pratico di laboratorio. Saranno descritte le modificazioni post traslazionali di proteine e le procedure di ricostituzione delle metalloproteine. Gli argomenti del corso saranno trattati attraverso lezioni frontali e esercitazioni di laboratorio