B020968 - METABOLOMICA E PROTEOMICA STRUTTURALE NEL DRUG DISCOVERY

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La pipeline del drug discovery dopo il sequenziamento del genoma. Primi successi del nuovo approccio. Le tre fasi cliniche. Concetto di patologia target e target. Definizione di farmaco. La metabolomica. Concetto di drug design razionale e irrazionale. La scelta del target molecolare. Target proteici e non proteici. Target e pathway. Interazione fra due proteine come bersaglio. Definizione di recettore. Cinetica enzimatica. Predizioni ADMET. Le 5 “regole del 5” di Lipinski. Programmi di docking. Structure-based drug-design. Fragment-based drug-discovery. SAR-by-Xray: soaking e cocristallizzazione. High-throughput screening (HTS) in vitro. Screening con NMR.

La pipeline del drug discovery dopo il sequenziamento del genoma. Primi successi del nuovo approccio. Tempi e costi. Definizione di GLP e GMP. Le tre fasi cliniche. Accorpamento di fase I e II per gli antitumorali. La “quarta” fase clinica, o farmacogenomica. Concetti di riduzione esponenziale dei candidati farmaci e crescita esponenziale dei costi. Durata dei brevetti e scelta dei tempi di brevettazione. Concetto di patologia target e target. Target e pathway. I target classici: Enzimi, recettori, canali ionici, proteine strutturali. Fosfatasi (PP5) e MMP come esempi di metalloproteine target. Possibili alterazioni della pipeline, inversioni di step (p. es. anticipazione della farmacogenomica, posticipazione della scelta della patologia target).
Definizione di farmaco. La metabolomica. Concetto di drug design razionale e irrazionale. La scelta del target molecolare. Target proteici e non proteici. Target e pathway. Come si seleziona un target: genomica e proteomica, vicinanza dei geni nel cromosoma con altri geni nel pathway, coespressione. Tecniche di microarray per determinare variazioni di pattern di espressione tramite mRNA, o mRNA legato ai ribosomi. Proteomica tramite spettrometria di massa: frazionamento e digestione con tripsina. Spettri ESI e MALDI. Proteomica tramite 2D gel elettroforesi: isoelectric focusing e SDS-PAGE in due dimensioni. Proteomica combinata 2D gel e massa. Metabolomica per risalire ad alterazioni di pathway. Validazione del target: gene knockout o silenziamento con SiRNA. Interazione fra due proteine come bersaglio: i metodi Y2H (yeast two-hybrid) e pulldown assay. Metodi bioinformatici.Definizione di recettore. Recettori intra e extracellulari e di membrana. Agonisti e antagonisti. Curva dose-risposta. ED50. Effetto di antagonisti competitivi e noncompetitivi sulla curva dose-risposta. Definizione di costanti di binding e di dissociazione. Keq come rapporto kon/koff per rezioni monostadio. Dipendenza della velocità di scambio (koff) dalla Keq nel limite di kon diffusiva. Inibitori suicidi.
Cinetiche enzimatiche, Michaelis-Menten. Definizioni di Km, kcat e Vmax. Schemi cinetici più complessi. Inibizione competitive, uncompetitive e mixed. Non-competitive come caso speciale dell’inibizione mixed. Fit lineari e non lineari.
Ulteriori considerazioni sulla pipeline del drug discovery. Predizioni ADMET. Le 5 “regole del 5” di Lipinski.
Varie interpretazioni della drug-discovery pipeline: tutta in silico. Problemi di qualità della struttura del target. Programmi di docking: autodock. Generazione della griglia. Calcoli dell’energia. Qualità dei calcoli di docking.
Generazione del lead. Screening razionale e irrazionale in silico e in vitro. Vari casi: Strutture di target e legante note e ignote. QSAR.
Structure-based drug-design.
Fragment-based drug-discovery: SAR-by-NMR. Concetto e considerazioni termodinamiche. Guadagno entropico. Altre strategie: Anchoring, merging, tethering.
SAR-by-Xray: soaking e cocristallizzazione. Acqua ice-like e liquida nei cristalli di proteine. Diffusione di solvente e soluto. Alterazioni dovute a crystal packing forces.
High-throughput screening (HTS) in vitro. Fluorimetria, microcalorimetria, surface plasmon resonance (SPR).
Screening con NMR: Protein-observe, ligand-observe. Lega? Dove lega? Come lega? Quanto fortemente lega? Ligand-based: relaxation edited, Water-LOGSY, saturation transfer difference (STD), diffusion ordered NMR spectroscopy (DOSY). Protein-based: HSQC chemical shift perturbation (Dove?). Protein-ligand NOE (Come?). 15N- o 13C-filtered NOESY
Titolazioni via NMR: titolazione protein-observe via HSQC, limite di misurabilità della costante: Kd ca. = concentrazione proteina. Fit dell’isoterma di Langmuir per un sito. Ligand observe, teoricamente senza limiti, in pratica limitato a scambio veloce (quindi Kd non troppo piccola). Esperimenti di competizione. Problemi con inibizione mista.
Uso di metalli paramagnetici. Line broadening nel ligand-observe. Vantaggi e svantaggi.
Le metalloproteinasi di matrice (MMP) come esempio di target. Potenza e selettività.