Insegnamento mutuato da: B016295 - LABORATORIO DI ESPRESSIONE DI METALLOPROTEINE Laurea Magistrale in SCIENZE CHIMICHE Curriculum CHIMICA DELLE MOLECOLE BIOLOGICHE
Lingua Insegnamento
Italiano
Contenuto del corso
I contenuti del corso affrontano vari aspetti della biologia molecolare relative alle tecniche di espressione eterologa di proteine: dal DNA genomico all'isolamento della proteina. Estrazione di geni e procedure di clonaggio classiche e moderne ad alta efficienza. Le tecniche di over-espressione proteica in organismi batterici. Procedure di purificazione di proteine e di ricostituzione di metalloproteine.
Saranno forniti capitoli di libri e "review articles" relativi alle tematiche trattate.
Obiettivi Formativi
Conoscenza e applicazione delle principali tecniche di biologia molecolare per l’ espressione eterologa e la purificazione di proteine ricombinanti.
L'obiettivo finale dell'insegnamento e' quello di rendere lo studente capace di esprimere e purificare una proteina allo scopo di essere studiata mediante analisi spettroscopica.
Numero di ore relative alle attività in aula: 25 ore di insegnamento frontale e 35 ore di esercitazioni di laboratorio
Altre Informazioni
La frequenza alle esercitazioni di laboratorio e’ obbligatoria.
Modalità di verifica apprendimento
L'esame prevede un colloquio orale volto a verificare la conoscenza delle principali metodologie sperimentali affontate nel corso. Sarà inoltre verificata la comprensione e la capacità di analisi critica delle attività svolte durante le esercitazioni di laboratorio. Durante il colloquo sarà infine accertata la capacità dello studente di applicare le conoscenze acquisite ad alcuni problemi pratici proposti dal docente.
Programma del corso
DNA – Plasmidi - Mutagenesi
Polymerase Chain Reaction - Amplificazione di geni tramite PCR
Elettroforesi su gel - Isolamento del prodotto di PCR da gel
Enzimi di restrizione
Vettori di espressione
Preparazione del vettore per il clonaggio: digestione, defosforilazione, isolamento del vettore da gel.
Reazione di ligasi – Trasformazione
Espressione proteica in organismi batterici e culture cellulari
Rottura delle cellule – Rimozione acidi nucleici. Salting in. Salting out.
Dialisi. Ultrafiltrazione
Metodi per determinare concentrazione proteica
Tecniche di purificazione cromatografica: cromatografia per scambio anionico, per affinità, per esclusione molecolare
Elettroforesi di proteine
Tecniche di ricostituzione di una metalloproteina
Modificazioni post-traslazionali di proteine
Sistema Gateway
Cell-free
Produzione di proteine con diversi tipi di marcature isotopiche: 13C, 15N e 2H.
Dicroismo circolare